Аналіз публічних даних
Дані про лінії SARS-CoV-2 та дату вибірки з послідовностей, доступних з Чилі, були отримані з сайту Consorcio Genomas CoV2, доступного за адресою https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Дані про вакцинацію були отримані з публічних даних Міністерства науки, технологій, знань та інновацій, доступних за адресою https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Продукт 83).
Аналіз на інфекційну хворобу
Псевдотиповані віруси, що несуть різні білки-спайки SARS-CoV-2, готували так, як ми раніше описували12. Коротко кажучи, псевдотипи SARS-CoV-1 на основі ВІЛ-2 були одержані в клітинах HEK293T шляхом трансфекції pNL4.3-ΔEnv-Luc разом з відповідним вектором кодування, що кодує pCDNA-SARS-CoV-2 у молярному співвідношенні 1: 1. Плазміди, що кодують шип, оптимізований для кодону, позбавлений останніх 19 амінокислот С-кінцевого кінця (SΔ19), відомих для уникнення затримки в ендоплазматичній сітці12 були отримані шляхом синтезу генів або персоналізованого сайт-спрямованого мутагенезу (GeneScript) і містили такі мутації: лінія A (еталонна послідовність), лінія B (D614G), лінія B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), лінія P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) та лінія C.37 (G75V, T76I, 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Кожен препарат псевдотипу очищали центрифугуванням при 859 об / хв при кімнатній температурі, визначали кількісно за допомогою комплекту квантикінового аналізу ВІЛ-3,000 Gag p1 (системи R&D), аліквотували у 24% фетальній бичачій сироватці (Sigma-Aldrich) і зберігали при -50 ° C до використання. Різну кількість псевдотипованих вірусів (що визначається рівнем білка В80 ВІЛ-1 р24) використовували для інфікування клітин HEK-ACE2, а через 48 годин активність люциферази світлячка вимірювали за допомогою реагенту для аналізу люциферази (Promega) на мікропланшеті Glomax 96 люмінометр (Promega).
Аналіз нейтралізації
Аналізи нейтралізації вірусу псевдотипу були проведені по суті, як ми раніше описували12. Коротко, серійні розведення зразків плазми (1: 4 до 1: 8748) готували в DMEM з 10% фетальної бичачої сироватки та інкубували з 5 нг р24 кожного псевдотипованого вірусу протягом 1 год при 37 ° С, а потім 1 × 104 клітин HEK-ACE2 додавали до кожної лунки. Клітини HEK293T (не експресують ACE2), інкубовані з псевдотипізованим вірусом (лінія А), використовували як негативний контроль. Клітини лізували через 48 годин, і активність люциферази світлячка вимірювали за допомогою реагенту для аналізу люциферази (Promega) у люмінометрі Glomax 96 Microplate (Promega). Відсоток нейтралізації для кожного розведення обчислювали, а ID50 кожного зразка обчислювали за допомогою GraphPad Prism версії 9.0.1.
Статистичний аналіз
Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism версії 9.1.2. Кілька групових порівнянь щодо нейтралізації титрів антитіл (NAbT) щодо групи вірусів псевдотипу SARS-CoV-2, а також порівняння реакцій NAbs за статтю та статусом диму проводили за допомогою парного тесту з підписаним рейтингом Уілкоксона. Зміна коефіцієнта розраховувалася як різниця середнього геометричного титру в ID50 порівняно з вірусом псевдотипованого вірусу типу Wild. Кореляційний аналіз між NAbT та віком чи ІМТ проводили за допомогою тесту Спірмена. Для статистичного аналізу зараженості проводили односторонній тест ANOVA та тест Тукі. Значення p ≤ 0.05 вважалося статистично значущим.
Етичне схвалення
Протокол дослідження був затверджений Комітетом з етики Медичного факультету Університету Чилі (проекти № 0361-2021 та № 096-2020) та Клінікою Санта-Марія (Проект № 132604-21). Усі донори підписали усвідомлену згоду, а їх зразки були анонімізовані.
Вплив спайкових мутацій у варіанті лямбда на інфекційність та реакції нейтралізації антитіл
Аналіз 3695 послідовностей з Чилі, депонованих у GISAID станом на 24 червняth 2021 р. Показує явне домінування варіантів SARS-CoV-2-гамми та лямбди-протягом останнього триместру, разом, для 79% усіх послідовностей.
Цікаво, що цей період характеризується масовою кампанією вакцинації, в якій станом на 65.6 червня 18% цільового населення (27 років та старші) отримали повну схему вакцинації.th 2021
Враховуючи, що 78.2% людей, щеплених за повною схемою, отримали інактивовану вірусну вакцину CoronaVac від Sinovac Biotech, ми намагалися дослідити вплив спайкових мутацій, наявних у варіанті Лямбда, на нейтралізуючу здатність антитіл, викликаних цією вакциною.
Для цього ми генерували псевдотиповані віруси на основі ВІЛ-1 SARS-CoV-2, що несуть білок-шип із референтної лінії Ухань-1 (дикий тип; лінія А), мутації D614G (лінія В) та альфа (лінія В) .1.1.7), варіанти гамми (лінія P.1) та лямбда (лінія C.37).
Під час підготовки до вірусу ми послідовно спостерігали, що клітини, інфіковані псевдотипізованим вірусом, що несе лямбда -шип, виробляють значно більші значення біолюмінесценції порівняно з мутантом D614G або варіантами альфа та гамми, що вказує на підвищену заразність, спричинену білком лямбда -шипа
Малюнок 1.Інфекція, опосередкована різними білками -шипами.
(А) Схематичне зображення протеїну-спайку SARS-CoV-2 та варіанти, використані у цьому дослідженні. Лінії вказуються в дужках. RBD, рецептор-зв'язуючий домен, CM; цитоплазматичний хвіст.
(B) Титрування псевдотипів кожної лінії з використанням еквівалентних кількостей ВІЛ-1 p24. Активність люциферази світлячка вимірювали як одиниці відносної люмінесценції (RLU) через 48 годин після зараження. Середнє значення та SD були розраховані з репрезентативного триразового експерименту.
Далі ми використовували згадані вище псевдотипізовані віруси для проведення аналізів нейтралізації, використовуючи 79 зразків плазми від здорових медичних працівників з університету Чилі та Клініка Санта -Марія в Сантьяго, Чилі.
Ми виключили 4 зразки, оскільки нам не вдалося обчислити титр ID50. З аналізованих зразків 73% відповідали жінкам, середній вік 34 роки (IQR 29 - 43) та індекс максимального тіла (ІМТ) 25 (IQR 22.7 - 27). 20.5% учасників заявили, що є активними курцями, поки тривав період імунізації. Зразки були отримані через 95 днів (IQR 76-96) після другої дози вакцини CoronaVac
Ми помітили, що нейтралізація псевдотипованого вірусу, що несе білок колоса Wild, призвела до 50% -ного інгібіторного розведення (ID50) середній титр 191.46 (154.9 - 227.95, 95% ДІ,), тоді як він становив 153.92 (115.68 - 192.16, 95% ДІ), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% ДІ), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% ДІ) ) та 78.75 (49.8 - 107.6, 95% ДІ) для псевдотипованих вірусів, що несуть спайковий білок з мутанта D614G або варіантів альфа, гамма та лямбда, відповідно.
Ми також помітили, що середній геометричний титр ID50 титри зменшилися в 3.05 рази (2.57 - 3.61, 95% ДІ) для псевдотипованого вірусу, що несе лямбда -спайк, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% ДІ) для гамма -спайку, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% ДІ) для шипа Альфа та 1.37 (1.20 - 1.55, 95% ДІ) для спайку D614G у порівнянні зі спайком дикого типу.
У нашій когорті дослідження не було виявлено кореляції між статтю, віком, індексом маси тіла (ІМТ) або статусом диму та титрами нейтралізуючих антитіл.
Малюнок 2.Аналіз нейтралізації з використанням зразків плазми вакцинованих проти CoronaVac
(A) Зміни у зворотному титрі нейтралізації 50% (ID50) у зразках плазми 75 реципієнтів вакцини CoronaVac проти D614G (лінія B), альфа (лінія B.1.1.7),
Варіанти гамми (лінія P.1) та лямбди (лінія C.37) порівняно з вірусом дикого типу. Результати показані як різниця у титрах нейтралізації відповідних зразків. P значення для порівняння ідентифікатора50 розраховуються за тестом підписаного рангу Уілкоксона.
(В) Діаграми в коробках вказують на середній та міжквартильний діапазон (IQR) ID50 для кожного псевдотипованого вірусу. Зміни факторів відображаються як різниця середнього геометричного титру в ID50 порівняно з вірусами псевдотипованого вірусу типу Wild. Статистичний аналіз проводили за допомогою критерію рангового збігу пар Уілкоксона.
Разом наші дані показали, що білок -спайк нещодавно визнаного цікавого варіанту Лямбда, який активно циркулює в країнах Чилі та Південної Америки, несе мутації, що спричиняють підвищену заразність та здатність втекти від нейтралізуючих антитіл, викликаних CoronaVac.
